Métodos de estudio
Imagen de alta resolución de la biopsia de un paciente con quiste hepático ciliado de intestino proximal. La preparación está realizada mediante tinción con hematoxilina-eosina y en su parte superior se puede observar el epitelio columnar ciliado característico de este tipo de neoplasia.
A nivel macroscópico, existen pruebas diagnósticas que permiten verificar la función ciliar con fines clínicos. Uno de los métodos más baratos y que cuenta con una aceptable fiabilidad es el test de la sacarina, que permite determinar el tiempo de transporte mucociliar nasal (TTMCN).[25]
Entre los organismos modelo que se han empleado en el estudio de diversos aspectos de la estructura y la función de los cilios, debido a las ventajas que ofrecen, cabe destacar los protozoos Tetrahymena, Chlamydomonas y Paramecium, el nemátodo Caenorhabditis elegans, embriones de erizo de mar o distintos tejidos de mamífero, como las células epiteliales de vías aéreas, células tubulares renales o células embrionarias nodales.[26]
Se han desarrollado numerosas técnicas de cultivo celular de tejidos de mamífero con cilios móviles, para fines clínicos e investigación. En el cultivo de epitelio ciliado de vías respiratorias se emplean métodos monocapa, monocapa secuencial, con interfaz aire-líquido y tridimensionales. Estos cultivos requieren el uso de técnicas en cámaras bifásicas, un sustrato de gel de colágeno con la suficiente profundidad, control del nivel de calcio y la vitamina A, factores de crecimiento como el factor de crecimiento epidérmico, insulina, y hormonas esteroideas para la diferenciación de las células mucosas, y la adición de antibióticos.[27] [28] [29] [30]
El microscopio óptico se ha utilizado durante más de tres siglos para el estudio de los cilios. Las tinciones habituales en las técnicas histológicas pueden revelarlos. Sin embargo, cuando se trata de estudiar el movimiento de estos orgánulos, es necesario utilizar microscopios que permitan la observación de células vivas. Dependiendo del organismo o del tipo celular a observar, se puede emplear un microscopio de campo oscuro, de contraste de fases o de interferencia diferencial de contraste (DIC), siendo este último el más empleado. Adicionalmente, y dada la elevada frecuencia de batido (en ocasiones hasta 100 Hz) se precisa de métodos de videograbación de alta velocidad y resolución, y software de análisis de imagen, movimiento o flujo.[18] [31] [32]
Larva trocófora del anélido Pomatoceros lamarckii en el que se observan cilios en la zona esofágica y gástrica mediante técnicas inmunohistoquímicas que emplean anticuerpos contra tubulina acetilada.
La inmunofluorescencia se emplea especialmente en la inmunolocalización de algún componente concreto del cilio, o bien para trazar el transporte intraflagelar. En muchos casos es importante inmovilizar las células para posteriores manipulaciones. Esto se puede efectuar confinándolas entre dos vidrios con una separación estrecha, procurando no distorsionar las estructuras celulares. Se emplean algunos pasos especiales, como la adición de un tampón químico especial para estabilizar microtúbulos (MTSB), o la elección cuidadosa de un detergente permeabilizador para evitar que se extraigan los componentes desados. Son habituales el MTSB-tritón y el Nonidet. En ocasiones es recomendable la fijación con metanol en frío, ya que fija y permeabiliza la muestra simultáneamente. Los tampones de lavado tras la fijación son un paso crítico. Por ejemplo, Chlamydomonas funciona mejor con Hepes (pH=6,8) mientras que los cultivos de vertebrados dan mejores resultados con Pipes (pH=7,2). La elección del anticuerpo primario depende de lo que se desee observar. Para fines generales se puede usar anticuerpos monoclonales contra alfa-tubulina acetilada de conejo, mientras que en el caso del estudio del transporte intraflagelar puede servir anti-IFT27. Es necesario considerar si el anticuerpo va a inactivar el blanco elegido. Se pueden utilizar anticuerpos marcados con oro en experimentos de inmunolocalización por microscopía electrónica, procurando que el tamaño de los anticuerpos sea el menor posible.[33] [34]
Los primeros trabajos en microscopía electrónica que caracterizaron el axonema y otros elementos de la estructura ciliar se están revisando con una nueva técnica, la tomografía crioelectrónica, en la que las muestras son vitrificadas a temperaturas muy bajas (algunos microscopios son enfriados con helio líquido) y posteriormente fotografiadas desde todos los ángulos, reconstruyéndose posteriormente una imagen tridimensional de la estructura con una resolución que alcanza los 2 nm. Una ventaja adicional de esta técnica debido a la rápida congelación, es que permite detener la célula o los complejos proteicos en un estado particular.[35]
Entre los organismos modelo que se han empleado en el estudio de diversos aspectos de la estructura y la función de los cilios, debido a las ventajas que ofrecen, cabe destacar los protozoos Tetrahymena, Chlamydomonas y Paramecium, el nemátodo Caenorhabditis elegans, embriones de erizo de mar o distintos tejidos de mamífero, como las células epiteliales de vías aéreas, células tubulares renales o células embrionarias nodales.[26]
Se han desarrollado numerosas técnicas de cultivo celular de tejidos de mamífero con cilios móviles, para fines clínicos e investigación. En el cultivo de epitelio ciliado de vías respiratorias se emplean métodos monocapa, monocapa secuencial, con interfaz aire-líquido y tridimensionales. Estos cultivos requieren el uso de técnicas en cámaras bifásicas, un sustrato de gel de colágeno con la suficiente profundidad, control del nivel de calcio y la vitamina A, factores de crecimiento como el factor de crecimiento epidérmico, insulina, y hormonas esteroideas para la diferenciación de las células mucosas, y la adición de antibióticos.[27] [28] [29] [30]
El microscopio óptico se ha utilizado durante más de tres siglos para el estudio de los cilios. Las tinciones habituales en las técnicas histológicas pueden revelarlos. Sin embargo, cuando se trata de estudiar el movimiento de estos orgánulos, es necesario utilizar microscopios que permitan la observación de células vivas. Dependiendo del organismo o del tipo celular a observar, se puede emplear un microscopio de campo oscuro, de contraste de fases o de interferencia diferencial de contraste (DIC), siendo este último el más empleado. Adicionalmente, y dada la elevada frecuencia de batido (en ocasiones hasta 100 Hz) se precisa de métodos de videograbación de alta velocidad y resolución, y software de análisis de imagen, movimiento o flujo.[18] [31] [32]
Los primeros trabajos en microscopía electrónica que caracterizaron el axonema y otros elementos de la estructura ciliar se están revisando con una nueva técnica, la tomografía crioelectrónica, en la que las muestras son vitrificadas a temperaturas muy bajas (algunos microscopios son enfriados con helio líquido) y posteriormente fotografiadas desde todos los ángulos, reconstruyéndose posteriormente una imagen tridimensional de la estructura con una resolución que alcanza los 2 nm. Una ventaja adicional de esta técnica debido a la rápida congelación, es que permite detener la célula o los complejos proteicos en un estado particular.[35]
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